二十九歲來到台灣的馬雅各，在台灣服務七年後，返回英國休假，沒想到卻因脊椎病痛無法再回台灣。
返國休假時，馬雅各依然繼續白話字聖經的翻譯工作，一八七三年他在英國完成台語新約聖經。
一八八○年，他更奉獻一台羅馬字拼音的小型印刷機，及排字架、鉛字等印刷工具，運送到台灣。這套印刷機對日後台灣南部教會推行羅馬字拼音白話字有很大的貢獻，長老會傳教士也因此之便，深入台灣民間，在台灣諸教會中向以貼近基層人民生活與思想而著稱。今天，台灣長老會依然以近二十二萬信眾人數，居基督教各教派之首。
離開台灣的馬雅各仍未停止對台灣的關懷，他經常四處演講關於台灣的醫療事工，及中台灣建立醫館的重要性，並積極尋求經費。
離開台灣十二年後，一八八三年底，馬雅各偕同夫人又再度回到台灣，回到昔日自己開拓的宣教根據地，見到自己一手親植的教會，內心非常喜樂。但因夫人體弱，一八八四年十月又再度返回英國。此後，他就沒有機會再踏上台灣的土地。
馬雅各回英國後，由德馬太醫師接手他在台灣的醫療傳道工作。
一九○○年，安彼得醫師在東門路現址興建新醫館樓房，正式取名為「新樓醫院」。
馬雅各在台灣行醫傳道六年半，足跡遍佈中南部，設立了南區西拉雅族（木柵、左鎮）、中區和雅族（白河、嘉義）、北區巴宰族（埔里、豐原、神岡）等三個教區。
根據文獻，一八七二年，台灣南部有禮拜堂二十二所，成人七百八十四名受洗，禮拜出席平均人數三千五百名，成人會員一千六百三十二名。
醫療工作之外，翻譯白話字聖經也是馬雅各對傳教工作的一大貢獻。
原來，以平埔族為主要對象、經常往來山區教會的馬雅各發現，平埔族和漢人的買賣土地契約書，用的是荷蘭拼音的羅馬字，俗稱為「番仔契」。此一發現，給予馬雅各用羅馬拼音將聖經翻譯成台語的靈感，因為學習漢文要費時多年，羅馬拼音文字卻只要幾個月的功夫就可以駕輕就熟，於是他著手翻譯台語的新約聖經，今天長老教會使用的台語聖經，便出自馬雅各之手。
營造府城成為台灣的宣教中心，一直是英國長老教會的目標。在「樟腦紛爭」之後，傳教士有了宣教權和保障，於是一八六八年馬雅各又重返府城安平，在二老口租下許家大厝，重開醫館，開始了後人俗稱「舊樓」（新樓醫院的前身）時期的醫療傳道工作。
馬雅各是一位傑出的外科醫生，求助於他的病人也多以外科居多，眼疾、難產、手腳潰爛……等各式各樣的病症，四處求醫無效時，都轉而來找馬雅各。
而醫療也確實對馬雅各的傳道工作產生非常大的助益。長老教會黃茂卿指出：「唯有解救人的生命和解除病痛等實際經驗，最容易消除人們對基督教的反感和排斥，初期信徒大多數是因醫療而接受福音的。」
特別的是，馬雅各多以平埔族為宣教的對象，初期所建立的教會也全都是屬於平埔族的教會。究其原因，主要是因為性格單純的平埔族在當時常受漢人欺壓，買賣經常受騙，相較之下，「紅番」醫生馬雅各的愛心深深打動平埔族人，很快就傳遍各部落。
馬雅各初期在台灣醫療傳道的路途十分坎坷，除了文化的藩籬、觀念的差異，當年傳道的時空背景也十分複雜。上帝愛世人的昭告無法打破民眾先前船堅炮利的印象；基督教義與經濟利益、救人的醫療和害人的鴉片，糾結、混淆不清，民眾普遍知識程度不高、生活水準低落，對外來文化既恐懼又排斥。
台灣基督教長老教會長老黃茂卿在《台灣基督長老教會太平境馬雅各紀念教會設教一百二十年史》一書中，提及馬雅各宣教之初的時代背景：「設教之初，台灣人眼見基督教的來臨，是隨著外國兵炮洋槍，經濟侵略和不平等條約同時而來，無法接受福音。何況來台的英國人中，確有許多牟利不屑舉動……」
清華大學歷史所教授傅大為稱當年傳教士「挾著外科利器與奎寧白粉行走東方」的醫療傳道為「半殖民醫療」，他在「從馬偕談清末台灣的半殖民醫療」一文中指出，最早來台的馬雅各醫師常遇困難與衝突，而後來台的傳教士之所以較為順利，是拜「樟腦紛爭」之賜。
話說當時擔任清朝海關職員的英籍人士必麒麟，明知樟腦是台灣專賣品，卻在非條約港梧棲買下一批樟腦，企圖以英國人的威勢走私牟利，被查獲沒收。
在此同時，長老會在埤頭（鳳山）的教會遭破壞，馬雅各來台宣教所收的第一位信徒──高長，在鳳山傳道時，被暴徒痛毆，並關進監獄。
樟腦紛爭加上教會遭破壞，英國從香港出動二艘軍艦攻擊安平。事後，清廷除了賠償教會的損失外，並明文宣布外籍宣教士在島內有居住、傳教之權，迫害基督教與信徒係犯法。
不過，當時民眾甚至政府官員，對基督教仍是充滿憤怒與歧視。
（中央社記者楊思瑞台南20日電）台南市政府感念已故英國傳教士、醫師馬雅各（James Laidlaw Maxwell）對台灣現代化醫療貢獻，近日前往馬雅各出生地英國愛丁堡懸掛紀念碑牌，並象徵台南與愛丁堡間友誼。
台南市長黃偉哲今天透過新聞稿表示，台南曾在2021年馬雅各逝世百週年時盛大舉辦紀念活動，如今能在台南400年、新樓醫院160年以及愛丁堡邁入900年時，於馬雅各出生地懸掛紀念碑牌，不僅感念馬雅各奉獻，更是台南與愛丁堡從19世紀以來交流歷史見證。
黃偉哲表示，感謝台灣基督長老教會、新樓醫院、愛丁堡大學、愛丁堡市議會、愛丁堡市政府、蘇格蘭台灣協會以及駐英國台北代表處愛丁堡辦事處等單位協力，讓紀念碑牌得以順利鑄造，並懸掛在愛丁堡市區要道上，供來往行人和遊客紀念。
台南市政府提供資料指出，馬雅各紀念碑牌懸掛於其出生地愛丁堡卡農門（Canongate）200號附近的西蒙勞瑞之家（Simon Laurie House），位於愛丁堡舊城區熱鬧道路上，現屬於愛丁堡大學所有，馬雅各為英國長老教會首名派遣到台灣的醫療宣教士，對台灣醫療發展有深遠影響。
台南市政府指出，紀念碑牌上刻有馬雅各對台灣與台南醫療貢獻，掃描QR Code則可直接連結至他生平介紹網頁；碑牌上同時陳列台南市徽、愛丁堡市徽及新樓醫院院徽，象徵台南與愛丁堡因馬雅各串起的友好情誼。
馬雅各19世紀後期到台灣南部傳教及行醫，在台南創建台灣首座西式醫院看西街醫館（今天的新樓醫院），1921年在英國去世，享壽85歲。（編輯：謝雅竹）1130620
「一府、二鹿、三艋舺」，早期台灣幾個繁榮的地區都在港口，排名第一的台南府城，自然是宣教師進入台灣傳教時的第一個據點。
一八六五年五月二十八日，馬雅各隨著杜嘉德牧師和兩名信徒，在高雄旗津港上岸，六月十六日來到台南看西街亭仔腳開始他的傳道醫療工作，這一天便成為英國長老教會日後的「在台設教紀念日」。
在低矮的平房中，前半部做禮拜堂，後半部當診所，先講道、再看病、領藥，台灣第一家西醫診所就這麼開張了。
然而，作為開路先鋒，馬雅各在府城醫療傳道工作並不順利。他不僅受到當地中醫師的圍剿，當地居民甚至還謠傳他會挖人眼睛和心做藥，開業二十三天，禮拜堂兼診所就不得已被迫關閉。
馬雅各只好避走有英國領事館保護的旗後（打狗的政治中心），當年九月，他又在旗後設立一所可以容納八名患者的醫館，並在醫館對面設立禮拜堂。
